小麥粉及其制品中氨基脲的測定
BJS 201902
1 范圍
本方法規(guī)定了小麥粉及其制品中氨基脲殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。
本方法適用于小麥粉及以小麥粉為主要原料的各種制品中氨基脲殘留量的檢測。
2 原理
試樣經(jīng)鹽酸水解，鄰硝基本甲全過夜衍生，乙酸乙酯提取，旋蒸富集后，采用液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行定性檢測，采用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量測定。
3 試劑和材料
注：水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。
3.1試劑
3.1.1 甲醇（CH4O）：色譜純。
3.1.2 乙腈（C2H3N）：色譜純。
3.1.3乙酸乙酯（C4H8O2）：色譜純。
3.1.4乙酸銨（C2H7 NO2）：色譜純。
3.1.5 正己烷（C6H14）：色譜純。
3.1.6 鹽酸（HCl）：分析純。
3.1.7 鄰硝基本甲醛（C7H5NO3）：色譜純。
3.1.8 0.2 moL/L鹽酸溶液：準(zhǔn)確量取鹽酸（3.1.6）17 mL于1 L容量瓶中，用水定容至1 L。
3.1.9 0.1 moL/L鄰硝基本甲全溶液：稱取1.5 g鄰硝基本甲全（3.1.7）于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至100 mL
3.1.10乙腈飽和的正己烷：量取正己烷（3.1.5）80 mL于100 mL分液漏斗中，加入適量乙腈（3.1.2）后，劇烈振搖，待分配平衡后，棄去乙腈即可。
3.1.11 0.010 moL/L乙酸銨：準(zhǔn)確稱取0.772 g乙酸銨（3.1.4）于1 L容量瓶中，用水定容至1 L。
3.1.12 10%甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取10 mL甲醇（3.1.1）于1 L容量瓶中，用水定容至100 mL。
3.2 標(biāo)準(zhǔn)品
氨基脲及其同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的基本信息見表1，純度≥99.0%。
表1 氨基脲及其同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的基本信息
中文名稱 | 英文名稱 | CAS登錄號 | 分子式 | 相對分子量 |
氨基脲鹽酸鹽 | Semicarbazide Hydrochloride | 563-41-7 | CH6ClN3O | 111.53 |
氨基脲-13C,15N2 鹽酸鹽 | Semicarbazide-13C,15N2 Hydrochloride | 1173020-16-0 | CH6ClN3O | 114.56 |
3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配置
3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取14.9 mg（到0.0001g）氨基脲鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇（3.1.1）溶解并定容至刻度，配成濃度為200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18℃保存，存效期三個月。
3.3.2 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取14.7 mg（到0.0001g）氨基脲-13C,15N2 鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇（3.1.1）溶解并定容至刻度，配成濃度為200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18℃保存，存效期三個月。
3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液（3.3.1），置于200 mL棕色容量瓶中，用甲醇（3.1.1）溶解并定容至刻度，配成濃度為0.200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，-18℃保存，存效期一個月。
3.3.4 內(nèi)標(biāo)工作液：準(zhǔn)確量取0.2 mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液（3.3.2），置于200 mL棕色容量瓶中，用甲醇（3.1.1）溶解并定容至刻度，配成濃度為0.200 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作液，-18℃保存，存效期一個月。
4 儀器與設(shè)備
4.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源。
4.2 天平：感量分別為0.0001 g和0.01 g。
4.3 超聲波發(fā)生器。
4.4 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
4.5 離心機(jī)。
4.5 恒溫箱。
4.6 渦旋混合器。
4.7 高速離心機(jī)。
5 分析步驟
5.1試樣制備
從原始樣品中取出有代表性樣品約500 g，充分混勻，均分成兩份，分別裝入干凈密封袋作為試樣，密封，并注明標(biāo)記。將試樣置于室內(nèi)避光保存。
5.1.1 衍生化
稱取約2.0 g（至0.01 g）樣品，置于50 mL玻璃比色管中，加入10 mL 0.2 moL/L鹽酸（3.1.8），渦旋30s后，在依次加入內(nèi)標(biāo)工作液（3.3.4）50 μL，0.1 moL/L鄰硝基本甲全溶液（3.1.9）200 μL，超聲提取10 min，置37℃恒溫箱中過夜（16h）反應(yīng)。
5.1.2提取
衍生后加入乙酸乙酯（3.1.3）50 mL，具塞后劇烈震搖1 min，超聲提取10 min，用10 mL移液槍吸取上清液40 mL至100 mL蒸發(fā)瓶中，并將其接至旋轉(zhuǎn)器上，于45℃水浴中減壓蒸餾至干，加入2 mL10%甲醇水溶液（3.1.12）充分溶解，含油脂的樣品用4 mL乙腈飽和的正己烷（3.1.10）液液分配，除去脂肪，10000 r/min離心5 min，過0.20 μm有機(jī)濾膜后，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。
5.1.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液制備
分別稱取5份，每份約2.0 g（至0.01 g）陰性樣品，分別置于50 mL玻璃比色管中，均加入10 mL 0.2 moL/L鹽酸（3.1.8），渦旋30 s后，分別加入標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.3）10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL，添加濃度分別為1 μg/kg、2 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、20μg/kg，再加入內(nèi)標(biāo)工作液（3.3.4）50 μL（即內(nèi)標(biāo)含量為5 μg/kg），余下操作同5.1.1和5.1.2。當(dāng)樣品濃度超出線性范圍時，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度可根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。
5.2 儀器參考條件
5.2.1液相色譜條件
a）色譜柱：MGⅢ-C18柱，150 mm×2.1 mm（i.d.），5.0 μm，或性能相當(dāng)者；
b）柱溫：25℃；
c）進(jìn)樣量：10 μL；
d）流動相及洗脫條件見表2。
表2 流動相及線性梯度洗脫條件
時間/min | 流動相A（甲醇） | 流動相B（0.010 moL/L乙酸銨） |
0 | 15% | 85% |
3 | 55% | 45% |
11 | 55% | 45% |
11.1 | 15% | 85% |
15 | 15% | 85% |
e）流動相流速：0.3 mL/min。
5.2.2 質(zhì)譜條件
a）離子源：電噴霧離子源（ESI）；
b）掃描方式：正離子模式；
c）檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；
d）干燥氣溫度：340℃；
e）干燥氣流速：8 L/min；
f）霧化器壓力；40 psi；
g）毛細(xì)管電壓：4 000 V；
i）定性離子對、定量離子對及碰撞能量見表3。
表3 多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）條件
被測物質(zhì)名稱 | 母離子 | 子離子 | 碎裂電壓/ V | 碰撞能量/ eV |
氨基脲 | 209 | 166；192* | 100 | 10/10 |
氨基脲同位素內(nèi)標(biāo) | 212.4 | 195.1 | 120 | 5 |
注：*為定性離子
5.3 定性測定
被測目標(biāo)化合物選擇一個母離子，2個以上子離子，在相同實驗條件下，樣品中待測物質(zhì)的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)的保留時間偏差在±2.5%之內(nèi)；且樣品中被測組分定性離子的相對豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)的定性離子的相對豐度進(jìn)行比較，偏差不超過表4規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對應(yīng)的待測目標(biāo)化合物?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜色譜圖見附錄A的圖A.1。
表4定性確證時相對離子豐度的大允許偏差
相對離子豐度（%） | > 50 | > 20-50 | > 10-20 | ≤10 |
允許的大偏差（%） | ± 20 | ± 25 | ± 30 | ± 50 |
5.4 定量測定
5.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
按濃度由小到大的順序，將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.1.3）分別注入液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀中，按儀器參考條件（5.2）進(jìn)行測定，測定氨基脲及其內(nèi)標(biāo)峰面積，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物的濃度和內(nèi)標(biāo)的濃度的比值為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5.4.2 試樣溶液的測定
將試樣溶液（5.1.2）注入液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀中，按儀器參考條件（5.2）進(jìn)行測定，得到相應(yīng)的樣品溶液和內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積比值。利用根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣測定溶液中待測組分的濃度，平行測定次數(shù)不少于兩次。
5.5空白試驗
除不稱取試樣外，均按照以上步驟進(jìn)行。
6 結(jié)果計算
試樣中氨基脲含量按式（1）計算：
X=ρ ……………………………………（1）
式中：
X —試樣中氨基脲的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；
ρ —由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣中氨基脲的濃度，單位為微克每千克（μg/kg）；
注：計算結(jié)果需將空白值扣除,測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。
7 精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的差值不得超過算術(shù)平均值的15%。
8 其他
本方法對小麥粉及其制品中氨基脲殘留的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。
本方法在加標(biāo)量為1.0 μg/kg～10.0 μg/kg內(nèi)，加標(biāo)回收率為75.0%～105.3%。
空白試驗，應(yīng)無干擾。
附錄A
氨基脲特征離子質(zhì)量色譜圖
圖A.1 氨基脲及其同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM 色譜圖
本方法負(fù)責(zé)起草單位：北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估中心（北京市食品檢驗所）。
驗證單位：山東省食品藥品檢驗研究院、河北省食品檢驗研究院、國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（上海）、北京市理化測試分析中心、北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院。
主要起草人：耿健強(qiáng)、王浩、賈婧怡、陳江龍、張杉、趙文霞。
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